Cámara de Neubauer para el recuento de bacterias
Aunque se han desarrollado diversos instrumentos automatizados para el recuento de células, el hemocitómetro sigue siendo el método más utilizado para el recuento de células en todo el mundo. El hemocitómetro más utilizado es la cámara de Neubauer (o “Neubauer mejorada”).
Otros hemocitómetros son el Burker, el Thoma y el Fuchs-Rosenthal. Con ellos, las partículas (por ejemplo, leucocitos, eritrocitos, trombocitos, bacterias, esporas de hongos, polen) se cuentan visualmente al microscopio.
La cámara de Neubauer es una placa de vidrio gruesa con el tamaño de un portaobjetos de vidrio (30x70x4mm). La zona de recuento consta de dos áreas regladas de forma cuadrada. Hay depresiones o fosos a ambos lados o entre las zonas en las que están marcados los cuadrados, lo que da una forma de “H”.
La superficie delimitada es de 3 mm2 y está dividida en 9 cuadrados grandes de 1 mm2 cada uno. El gran cuadrado central (que puede verse en su totalidad con el objetivo de 10X), está dividido en 25 cuadrados medianos con líneas dobles o triples.
La cubierta de cristal es un cristal cuadriculado de 22 mm de ancho. La cubierta de vidrio se coloca en la parte superior de la cámara de Neubauer, cubriendo la zona central. La zona rayada es 0,1 mm más baja que el resto de la cámara.
¿Cómo se calcula la cámara de Neubauer?
Calcular el número de células contadas / µL. El recuento total de 4 conjuntos de 16 esquinas = (células / ml x 104) x 4 cuadrados de una cuadrícula del hemocitómetro. Dividir el recuento por 4. A continuación, multiplicar por 2 para ajustar la dilución 1:2 en caso de fijador.
¿Cómo se cuentan las células en la cámara de recuento?
Para calcular la concentración celular, tome el número medio de células viables en los cuatro conjuntos de 16 cuadrados y multiplíquelo por 10.000 para obtener el número de células por mililitro. A continuación, multiplíquelo por cinco para corregir la dilución de uno en cinco de la adición de azul tripán.
¿Cómo se calcula el recuento hemocitométrico?
Utilice la siguiente fórmula para calcular el número de células que tiene en su suspensión: (total de células contadas)/(4 cuadrados contados)*10-4*volumen inicial*factor de dilución = número total de células; Nota: 10-4 es el volumen de cuadrados en el hemocitómetro (0,1 mm3).
Factor de dilución de la cámara de Neubauer
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El hemocitómetro fue inventado por Louis-Charles Malassez y consiste en un portaobjetos de microscopio de vidrio grueso con una hendidura rectangular que crea una cámara de volumen de precisión. Esta cámara está grabada con una cuadrícula de líneas perpendiculares grabadas con láser. El dispositivo está cuidadosamente diseñado para que se conozca la zona delimitada por las líneas y la profundidad de la cámara. Observando un área definida de la cuadrícula, es posible contar el número de células o partículas en un volumen específico de fluido, y calcular así la concentración de células en el fluido en general. Un tipo de hemocitómetro muy utilizado es la cámara de recuento de Neubauer[2].
Neubauer mejoró
El hemocitómetro (o hemocitómetro o cámara de recuento) es un portaobjetos que se utiliza para determinar la concentración de células en una muestra líquida. Se utiliza con frecuencia para determinar la concentración de células sanguíneas (de ahí el nombre “hemo-“), pero también la concentración de espermatozoides en una muestra. El cubreobjetos, que se coloca sobre la muestra, no flota simplemente sobre el líquido, sino que se mantiene en su sitio a una altura determinada (normalmente 0,1 mm). Además, se graba una cuadrícula en el cristal del hemocitómetro. Esta rejilla, una disposición de cuadrados de diferentes tamaños, permite contar fácilmente las células. De este modo es posible determinar el número de células en un volumen determinado.
Aquí es necesario hacer algunas cuentas sencillas. Se necesitan los siguientes números: número de células contadas en un cuadrado, área del cuadrado, altura de la muestra, factor de dilución. El objetivo es encontrar el número de células en 1 ml de solución original.
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Recuento de células
El recuento de células (eucariotas y, sobre todo, de mamíferos) en un hemocitómetro es un método antiguo pero todavía valioso para cuantificar el número de células por mL en una suspensión. En los párrafos siguientes, hemos esbozado los puntos más importantes para el recuento con un hemocitómetro. También queremos dar pistas de por dónde empezar a solucionar problemas cuando surgen problemas con los recuentos.
En general, se pueden utilizar muchos tipos diferentes de cámaras para contar células. Sin embargo, la cámara de Neubauer mejorada y la cámara de Thoma son las más utilizadas en el cultivo celular. Aquí se ofrece un buen resumen de las subdivisiones de los cuadrados de recuento en los distintos tipos de cámara (con etiquetas en alemán) Optik Labor.
El azul tripán es una tinción vital. Esto significa que las células intactas no absorben el colorante y no se tiñen, mientras que las células muertas o dañadas absorben el colorante y aparecen de color azul a lila en el microscopio. La tinción se realiza mezclando una solución de azul tripán con la suspensión celular que se va a contar en un tubo de microrreacción (por ejemplo, de 1:2 a 1:10 en función de la densidad de la suspensión celular). Tras la mezcla, la solución se cuenta como de costumbre en el hemocitómetro. Se cuentan las células no teñidas = células vitales, sanas, y las teñidas de azul = células muertas, dañadas. A continuación se calcula el porcentaje de células vitales = células vitales / (vitales+células muertas). Dependiendo del tipo de célula, se documenta un rango normal de vitalidad (por ejemplo, 90-95% para muchas líneas celulares, 60-70% para muchas líneas de células T, 50-69% para hepatocitos primarios, etc.). Es importante señalar que el azul tripán en sí mismo es ligeramente citotóxico. Después de 5-10 minutos empieza a matar las células. Por lo tanto, las muestras no deben “almacenarse” durante más de 5 minutos antes del recuento.
